Evidencias morfológico-estructurales, fisiológicas y bioquímicas de embriotoxidad y teratogénesis en peces causadas por herbicidas a base de glifosato
Ensayo multiparamétrico de embriotoxicidad en pez cebra.
Laboratorio de Neurociencia Molecular y Toxicología del Desarrollo,
Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE)
1Viviana Bortagaray, 1Rosa Cruces Aramburu, 1Pilar Ojeda, Gabriela del Puerto, 1,2María Andrea Saravia, 1,2Daniel Rodríguez-Ithurralde.
1Laboratorio de Neurociencia Molecular y Núcleo de Biotecnología y Marcadores Moleculares, Instituto Clemente Estable, Av. Italia 3318, Montevideo, Uruguay. E-mail: drit@iibce.edu.uy
Introducción
Un cuerpo creciente de evidencia, procedente tanto de trabajos experimentales de laboratorio como de estudios de campo, sugiere que los herbicidas formulados en base a N-(phosphonomethyl)glycine (glifosato), los más ampliamente usados en todo el mundo y en Uruguay, presentan una toxicidad considerable para numerosas especies de algas, moluscos, peces y anfibios.
Dada la prolongada permanencia en el ambiente del glifosato , sus coadyuvantes y sus metabolitos, el uso incontrolado de estos herbicidas representa una amenaza seria para la biodiversidad, así como para los recursos pesqueros y la piscicultura. Es de interés señalar que se han detectado concentraciones no permitidas del herbicida, sus metabolitos y coadjuvantes, en aguas y alimentos para consumo humano, lo que causa preocupación como un peligro potencial para la salud humana y animal, y que por ende, debe ser rigurosamente monitoreado. El metabolito mas abundante del glifosato, el AMPA, es más tóxico que el propio glifosato, y más resistente a la degradación que él. En este trabajo, nos propusimos objetivar los efectos tóxicos de este compuesto, sobr el desarrollo del pez cebra.
Materiales y Métodos
En este trabajo hemos empleado nuestro previamente validado test multiparamétrico de embriotoxicidad en placas de ELISA, que permite medir numerosos parámetros morfológicos, fisiológicos y bioquímicos en cientos de ensayos simultáneos con sensibilidad, alta reproductibilidad y bajo costo (Ojeda et al., 2007). Embriones de Danio rerio de una hora post-fecundación (hpf), se incubaron en placas de ELISA a una temperatura de 27.5 ± 1ºC, a razón de uno por pocillo de placa, en presencia de concentraciones finales (ccf) pre-establecidas de glifosato. Se verificó la presencia de puntos finales pre-establecidos del desarrollo del pez cebra, que son aceptados en la literatura internacional, a las 24, 48, 72 y 96 hpf (Ojeda et al., 2007; Bortagaray et al., 2009). La determinación de colinesterasas se llevó a cabo por el método de Karlsson y cols. (1984), una modificación del método de Ellman y cols.
Resultados
Letalidad. Las curvas de mortalidad mostraron que a partir de una concentración final (ccf) de glifosato de 25 microg/ml, la letalidad del glifosato sobre los embriones fue significativamente dependiente de la concentración del herbicida y del tiempo de exposición. A las 24 hpf se verificaron letalidades del 35.4% a ccf de 50 microg/ml, del 74% a ccf de 75 microg/ml y del 82% a ccf de 150 microg/ml, mientras que en los embriones control se mantuvo entre 0-5%.
Eventos de eclosión. Si bien la mayoría de los puntos finales de carácter morfológico-estructural mostraron un retardo en el tiempo de aparición o en su evolución en los embriones expuestos al glifosato, los eventos de eclosión se vieron, en la mayoría de los casos, acelerados. Así, a ccf de glifosato de 12.5-50 microg/ml, la efracción del corion y consecuente eclosión aparecieron más precozmente que en los embriones control. La proporción de embriones eclosionados a las 72 hpf, para dar un ejemplo, fue significativamente mayor que en los controles. La consecuencia inmediata de este hecho es que llegan a ponerse en contacto directo con el medio acuático externo, formas más inmaduras que en los controles, dado que los controles eclosionan significativamente más tarde.
Alteraciones cardíacas y pericárdicas. La frecuencia cardíaca embrionaria a las 48 hpf disminuyó significativamente, con relación a los controles sin glifosato, a partir de ccf de 25 microg/ml. A ccf de 50 microg/ml, se comprobó edema cardíaco, así como retardo en la separación del saco vitelino. A ccf de 75 microg/ml o superiores, todos los embriones mostraron alguna alteración fisiopatologica o estructural del desarrollo, tales como: edema cardio-pericárdico, enlentecimiento circulatorio, o las consignadas en la siguiente sección.
Otras alteraciones fisiopatológicas y bioquímicas. En embriones expuestos a ccf de 75 microg/ml o superiores, el ensayo para colinesterasas de Karlsson y cols. (1984), realizado en el embrión total, mostró una inhibición del las colinesterasas totales y de las acetilcolinesterasa (AChE) de los embriones del orden del 40%., También se comprueba disminución de los movimientos de flexión del tronco, o retardo de su aparición, en estadios en que deben estar presentes.
Malformaciones digestivo-vitelinas. Son frecuentes las alteraciones morfológicas del saco vitelino, o ausencia de separación del mismo. A ccf de 50 microg/ml apareció un retardo en la separación del saco vitelino. Algunas de las malformaciones registrads son, por lo graves, incompatibes con la vida.
Alteraciones y malformaciones musculo-esqueléticas. Se comprobaron malformaciones de distinto grado del esqueleto axial y apendicular. Los embriones presentan incurvaciones, gibas, y angulaciones de la columna vertebral y variadas malformaciones y divisiones de cola o aletas.
Discusión y Conclusiones
Se han verificado un conjunto de alteraciones en parámetros tanto funcionales, como bioquímicos, como morfológicos. Existe una correlación entre la concentraciónes mas altas y la gravedad de las alteraciones comprobadas, con la excepción de aquellos casos en que, por estar expuestos a concentraciones muy elevadas, los embriones mueren en pocos minutos u horas.
La eclosión precoz podría ser una causa adicional de mortalidad, ya que eliminar la protección del corion en embriones todavía inmaduros en cuanto a su capacidad de adaptación al medio acuático externo. Esta eclosión precoz puede, cuando ocurre en el ambiente habitual del cuerpo de agua, causar mortandades de embriones determinadas por la acción de otros agentes químicos, físicos o biológicos, al carecr el embrión de la protección fisicoquímica que le proporciona el corion.
En suma, hemos demostrado efectos tóxicos letales y no letales, así como efectos teratogénicos del glifosato a rangos de concentración que han sido previamente publicados como atóxicos. Es muy importante destacar que las concentraciones que empleamos en estos experimentos son inferiores en 1-3 órdenes de magnitud a las que se han comprobado en cuerpos de agua vecinos a cultivos de Argentina y Uruguay. Así, por ejemplo, en rigurosas mediciones realizadas en la localidad de Pergamino, Argentina, en cuerpos de agua cercanos a los cultivos tratados con el herbicida, los niveles de glifosato comprobados en el agua variaron a lo largo del año y el día entre 0.1 y 0.7 mg/ml, es decir, no bajaron nunca de 0.1 mg/ml.
2 Trabajo apoyado por PEDECIBA (Biología)
